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熒光定量PCR檢測

熒光定量原理：

熒光定量PCR技術(shù)是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時監(jiān)控反應(yīng)過程。隨著PCR 反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)產(chǎn)物不斷累積，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一次熒光強(qiáng)度信號，這樣就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，結(jié)合相應(yīng)的軟件對產(chǎn)物進(jìn)行分析，可以得到熒光擴(kuò)增曲線，計(jì)算待測樣品初始模版的量。

應(yīng)用：

實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)是一次由定性技術(shù)向定量技術(shù)的飛躍，運(yùn)用該項(xiàng)技術(shù)，可以對DNA、RNA樣品進(jìn)行相對定量、絕對定量和定性分析。

服務(wù)內(nèi)容：

1. 客戶提供樣品及檢測基因信息

2. 樣品抽提及反轉(zhuǎn)錄

3. 引物及探針設(shè)計(jì)

4. 標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建（針對絕對定量）

5. PCR反應(yīng)條件優(yōu)化及引物驗(yàn)證

6. PCR上機(jī)正式實(shí)驗(yàn)

7. 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析及GraphPad專業(yè)繪圖軟件繪制柱狀圖

交付內(nèi)容：

提供數(shù)據(jù)及實(shí)驗(yàn)報(bào)告，包括實(shí)驗(yàn)方法、步驟、所用試劑、儀器、RNA電泳圖片、擴(kuò)增曲線、溶解曲線及GraphPad專業(yè)繪圖軟件繪制柱狀圖。

業(yè)務(wù)范圍：SYBR-Green染料法對DNA/RNA進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測，包括mRNA、miRNA和DNA的相對和絕對定量分析。

相對定量：通過2－ΔΔCt法計(jì)算比較目的基因的表達(dá)差異。

絕對定量：需要先制備標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行等比例稀釋，與待測目的基因同時進(jìn)行PCR，通過比對標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中特定基因的拷貝數(shù)、摩爾數(shù)或者微克數(shù)等。

Western Blot檢測

原理：

WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜上，以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以硝酸纖維素薄膜上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白。

應(yīng)用：

通過抗原抗體反應(yīng)對目標(biāo)蛋白的表達(dá)進(jìn)行半定量檢測，還可用于蛋白-蛋白、蛋白-DNA和蛋白-RNA相互作用的后續(xù)分析。

服務(wù)內(nèi)容：

1. 配置膠

2. 樣品處理，蛋白抽提定量

3. SDS-PAGE電泳

4. 轉(zhuǎn)膜

5. 免疫學(xué)檢測

6. 圖片分析，整理報(bào)告

交付內(nèi)容：

交付實(shí)驗(yàn)報(bào)告包括實(shí)驗(yàn)方法、所用試劑、儀器及曝光結(jié)果（掃描圖）。

業(yè)務(wù)范圍：總蛋白、磷酸化蛋白

單克隆抗體生產(chǎn)

大規(guī)模單克隆抗體生產(chǎn)：目前主要有兩種方式，一是腹水制備法，另一種是轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法。

腹水制備法：將雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行體外培養(yǎng)至一定濃度，再將雜交瘤細(xì)胞注入小鼠腹腔中，產(chǎn)生腹水，從腹水中春華單克隆抗體。每只小鼠可以產(chǎn)生3~8ml腹水，抗體含量可以達(dá)到1~10mg/ml。腹水制備的周期為3~4周。腹水制備法具備成本低、產(chǎn)量高，時間快等優(yōu)點(diǎn)，是目前主要的大規(guī)?？搭}生產(chǎn)方式。

轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法：將雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行大規(guī)模體外培養(yǎng)，從培養(yǎng)基中純化抗體。抗體含量可以達(dá)到20~80ml/L。轉(zhuǎn)瓶制備法具有抗體品質(zhì)高、不含小鼠雜蛋白，不含動物病毒等優(yōu)點(diǎn)。

客戶提交樣本：

1、雜交瘤細(xì)胞活力至少大于80%的雜交瘤細(xì)胞株

2、雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基品牌、貨號、配制方法

交付結(jié)果：

1、純化好的單克隆抗體，純度90%以上

2、最終純化實(shí)驗(yàn)報(bào)告，其中報(bào)告純化SDS-PAGE圖和終濃度QC圖

多克隆抗體制備

多克隆抗體存在于免疫動物的血清中，可以從血清中純化獲得。多克隆抗體能識別多個抗原位點(diǎn)，可用于多種免疫學(xué)反應(yīng)，并且制備時間短，成本低，因此被廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)研究領(lǐng)域和免疫學(xué)診斷領(lǐng)域。

服務(wù)內(nèi)容

1、抗原的制備

多肽抗原合成→蛋白抗原制備→其他抗原制備

2、免疫

我們提供經(jīng)過優(yōu)化和驗(yàn)證的免疫方案，也可以根據(jù)客戶的要求進(jìn)行免疫。

3、抗血清的生產(chǎn)

4、抗體的純化

ProteinA/G純化、特異性親和純化

交付結(jié)果：

1、提供的多克隆抗體制備服務(wù)，多克隆的抗體的效價達(dá)到1：:16000以上

2、對于蛋白抗原的多克隆抗體，保證western blot檢測結(jié)果為陽性。蛋白抗原的純度大于85%。

磷酸化抗體定制服務(wù)

磷酸化抗體具體特異性識別磷酸化氨基酸的位點(diǎn)，可以確定蛋白質(zhì)是否磷酸化，對于磷酸化蛋白可進(jìn)行定性及定量分析。

磷酸化多克隆抗體制備流程：

1、磷酸化多肽的設(shè)計(jì)合成

2、合成多肽與載體蛋白偶聯(lián)

3、動物免疫、抗血清制備

4、抗體的純化及特異性親和純化

5、效價檢測

磷酸化單克隆抗體制備流程：

1、磷酸化多肽的設(shè)計(jì)合成

2、合成多肽與載體蛋白偶聯(lián)

3、動物免疫與檢測

4、細(xì)胞融合

5、篩選單克隆細(xì)胞株

6、效價檢測